Enjoy 15% off all rosemary skincare

Bahasa Indonesia Part 2

Blog post description.

6/15/20266 min read

3. Experimental part

3.1. Tujuan penelitian Tujuan utama penelitian ini adalah untuk menguji aktivitas antioksidan dari sediaan Med(i)ra (diproduksi oleh ROSA VITA d.o.o., Pula, Kroasia)—yang diformulasikan dari kompleks berbasis tanaman (hidrolat), asam rosmarinat, dan madu—pada kondisi stres oksidatif yang diinduksi secara in vitro dalam sampel biologis. Tujuan-tujuan lain yang mendukung pencapaian tujuan utama penelitian ini meliputi: • menentukan konsentrasi parameter stres oksidatif yang diukur sebelum dan sesudah penambahan pro-oksidan tert-butyl hydroperoxide (TBH) ke dalam sampel yang mengandung sediaan uji, serum murni, dan trolox. • menentukan potensi antioksidan sediaan Med(i)ra dibandingkan dengan antioksidan standar vitamin E dalam bentuk trolox (2 mmol/L).

3.2. Bahan dan metode

Untuk penelitian ini, digunakan "kumpulan" serum yang diperoleh dengan mencampurkan serum dari individu sehat, sediaan Med(i)ra sebagai sumber antioksidan, TBH 0,25 mmol/L sebagai prooksidan, serta trolox (2 mmol/L)—analog vitamin E yang larut dalam air—sebagai sediaan dengan aktivitas antioksidan yang telah diketahui.

Sediaan Med(i)ra (diproduksi oleh ROSA VITA d.o.o., Pula, Kroasia) terdiri dari kompleks tanaman, yaitu hidrolat dari empat spesies tanaman: rosemary (Rosmarinus officinalis), lavender (Lavandula angustifolia), adas (Foeniculum vulgare), dan juniper pesisir (Juniperus oxycedrus), serta penambahan asam rosmarinat (75 mg RA/10 mL produk) sebagai salah satu antioksidan utama, dan madu yang berasal dari lahan tanaman herbal aromatik yang juga digunakan untuk memproduksi hidrolat yang menjadi bagian dari sediaan tersebut.

Serangkaian pengenceran sediaan uji (100%, 50%, 25%) dalam volume 50 μL ditambahkan secara duplo ke dalam alikuot serum sebanyak 450 μL, diikuti dengan penambahan serangkaian pengenceran sediaan uji (100%, 50%, 25%) dan TBH (sebagai pro-oksidan) dengan volume total 50 μL (25 μL + 25 μL). Selain sampel-sampel tersebut, disiapkan pula sampel yang hanya ditambahkan TBH (50 μL), trolox sebagai antioksidan standar (50 μL), kombinasi TBH dan trolox (25 μL + 25 μL), serta kontrol serum dengan penambahan akuades (50 μL). Sampel-sampel tersebut diinkubasi dalam penangas air selama 2 jam pada suhu 37ºC; setelah itu, dilakukan pengukuran parameter stres oksidatif pada semua sampel, yaitu: status antioksidan total (TAS), paraoksonase-1 (PON1), kandungan total gugus sulfhidril (SHG), status oksidatif total (TOS), keseimbangan pro-oksidan-antioksidan (PAB), dan produk oksidasi protein lanjut (AOPP).

Status antioksidan total (TAS) mengukur reaktivitas total dari semua zat pereduksi dalam plasma, terutama protein, asam urat, glukosa, urea, kreatinin, serta vitamin E dan C. 19 Status antioksidan total ditentukan melalui uji kolorimetri dengan menggunakan kation ABTS+ yang stabil sebagai kromogen. Larutan ABTS itu sendiri tidak berwarna. Melalui oksidasi menjadi kation ABTS+ menggunakan hidrogen peroksida dalam medium asam (dapar asetat, pH=3,6), larutan tersebut memperoleh warna hijau zamrud yang khas. Ketika ion ABTS+ yang berwarna tersebut bercampur dengan zat yang dapat dioksidasi (antioksidan), ion ini tereduksi menjadi ABTS yang tidak berwarna; hal ini ditandai dengan perubahan warna, yaitu hilangnya warna pada larutan yang diuji. Intensitas perubahan warna tersebut sebanding dengan konsentrasi total antioksidan yang terdapat dalam sampel. Absorbansi larutan yang diuji diukur pada panjang gelombang 660 nm setelah inkubasi selama 10 menit pada suhu ruang (atau 5 menit pada suhu 37ºC). Pengukuran absorbansi dilakukan menggunakan alat otomatis Ilab 300+ (Instrumentation Laboratory, Milan, Italia). [44]

Paraoxonase 1 (PON1) adalah enzim yang disintesis di hati dan menjadi bagian dari komposisi partikel lipoprotein HDL (High Density Lipoprotein). PON1 memiliki kemampuan untuk mencegah pembentukan partikel LDL (Low Density Lipoprotein) baru serta menguraikan partikel LDL yang sudah ada, dan berperan penting dalam melindungi partikel LDL dari modifikasi oksidatif, yang berkontribusi terhadap potensi antioksidan organisme. [45] Penentuan status PON1 (berdasarkan metode Richter dan Furlong) mencakup pengukuran aktivitas enzim PON1 terhadap dua substrat non-fisiologis yang berbeda, yaitu paraoxon (aktivitas paraoxonase/POase) dan diazoxon (aktivitas diazoxonase/DZOase), serta penentuan fenotipe aktivitas untuk posisi 192 berdasarkan hasil tersebut. Aktivitas enzim diukur dalam serum atau plasma yang mengandung heparin. Plasma dengan EDTA tidak dapat digunakan karena, menurut beberapa penulis, EDTA secara langsung menyebabkan degradasi PON1(127), dan menurut penulis lain, PON1 merupakan esterase yang bergantung pada Ca2+ yang aktivitasnya terhambat oleh keberadaan EDTA yang mengikat Ca2+ membentuk kompleks. Serum digunakan dalam penelitian ini.

Penentuan aktivitas paraoksonase didasarkan pada kerja enzim PON1 dari serum terhadap substrat paraokson, yang menghasilkan konversi paraokson menjadi p-nitrofenol; laju perubahan ini dipantau secara kinetik pada panjang gelombang 405 nm, yang merupakan panjang gelombang serapan maksimum khas bagi p-nitrofenol (yang dalam medium basa berada dalam bentuk anion p-nitrofenoksida). Penentuan aktivitas diazoksonase didasarkan pada kerja enzim PON1 dari serum terhadap substrat diazokson (analog-O-diazinon), yang menghasilkan konversi diazokson menjadi 2-isopropil-4-metil-6-hidroksipirimidin (IMHP); laju perubahan ini dipantau secara kinetik pada panjang gelombang 270 nm, yang merupakan panjang gelombang serapan maksimum khas bagi IMHP. Alat Ilab 300+ (Instrumentation Laboratory, Milan, Italia) digunakan untuk pengukuran absorbansi. [44]

Gugus sulfhidril total (SHG) merupakan bagian dari sistem pertahanan antioksidan dan terutama berasal dari protein. Beberapa senyawa non-protein dalam tubuh kita (seperti antioksidan glutation) juga mengandung gugus ini yang memiliki kemampuan reduksi dan berfungsi menetralkan radikal bebas. Selain TAS, SHG membentuk lini pertahanan pertama dalam darah kita terhadap stres oksidatif. Kadar total gugus sulfhidril dalam plasma ditentukan menggunakan metode Ellman. Metode ini didasarkan pada reaksi antara asam 2,2'-dinitro-5,5'-ditio-benzoat (DTNB) dengan senyawa tiol alifatik dalam medium basa (pH 9,0), yang menghasilkan satu mol anion p-nitrofenol untuk setiap satu mol tiol. Karena anion ini berwarna kuning pekat dalam medium basa, absorbansinya dapat diukur pada panjang gelombang 412 nm. Kadar total gugus SH dapat ditentukan melalui kurva standar larutan glutation dalam air atau melalui kurva koefisien ekstingsi molar p-nitrofenol pada 412 nm. [44]

Total Oxidative Status (TOS) mengukur seluruh zat pengoksidasi dalam plasma, seperti hidrogen peroksida dan lipid hidroperoksida. Parameter ini berhubungan langsung dengan TAS (Total Antioxidant Status); jika salah satu meningkat, yang lain akan menurun, dan sebaliknya. TOS menggambarkan potensi oksidatif plasma, yaitu keberadaan komponen yang berpotensi merusak sel dan jaringan. Komponen utama sistem TOS dalam serum adalah H2O2 dan lipid hidroperoksida. Total oksidan yang terdapat dalam sampel mengoksidasi kompleks ion fero-orto-dianisidin menjadi ion feri. Reaksi oksidasi ini difasilitasi oleh molekul gliserol yang ada dalam medium reaksi. Ion feri yang terbentuk kemudian membentuk kompleks berwarna dengan xylenol-orange dalam lingkungan asam. Intensitas warna diukur secara spektrofotometri (λ=560 nm) dan berbanding lurus dengan total kandungan molekul oksidasi dalam sampel. Pembacaan absorbansi dilakukan menggunakan alat Ilab 300+ (Instrumentation Laboratory, Milan, Italia). [44]

Pengukuran keseimbangan pro-oksidan-antioksidan (PAB) memungkinkan penentuan beban pro-oksidan dan kapasitas antioksidan suatu organisme secara bersamaan. Berbeda dengan metode sebelumnya yang mengukur kadar pro-oksidan dan antioksidan secara terpisah, uji PAB memungkinkan penentuan pro-oksidan dan antioksidan secara simultan dalam sampel tertentu, sehingga dapat mengukur keseimbangan yang ada di antara keduanya. Uji PAB dilakukan menggunakan metode Hamidi-Alamdari dan rekan-rekan, dengan modifikasi tertentu. Uji ini menentukan konsentrasi hidrogen peroksida (H2O2) dalam lingkungan antioksidan. Kromogen 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) bereaksi dengan hidrogen peroksida dan antioksidan (asam urat) secara bersamaan karena ketiganya berada dalam lingkungan yang sama. Reaksi H2O2 bersifat kromogenik dan dikatalisis secara enzimatik oleh enzim peroksidase, di mana oksidasi TMB menghasilkan produk berwarna biru pekat. Sebaliknya, reaksi antara asam urat dan kromogen merupakan reaksi kimia tanpa katalis, di mana kation TMB direduksi menjadi produk yang tidak berwarna. Intensitas pewarnaan larutan standar berbanding lurus dengan rasio jumlah H2O2 dan asam urat yang ditambahkan. Kapasitas antioksidan dikalibrasi berdasarkan asam urat dan dinyatakan dalam µmol·L⁻¹ asam urat, sedangkan kapasitas pro-oksidan dikalibrasi terhadap H2O2 dan dinyatakan dalam µmol·L⁻¹ H2O2. Larutan H2O2 dan asam urat digunakan untuk membuat kurva standar dengan berbagai rasio, sehingga asam urat mendominasi pada satu titik ekstrem dan H2O2 pada titik ekstrem lainnya. Kedua komponen ini dipilih sebagai representasi pro-oksidan dan antioksidan karena keduanya tidak saling bereaksi dan tidak mengganggu aktivitas satu sama lain terhadap kromogen. Metode ini bersifat spektrofotometrik, dengan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 450 nm menggunakan pembaca ELISA. [44]

Produk oksidasi protein lanjut (AOPP – advanced oxidation protein products) merupakan bentuk kerusakan struktur protein yang disebabkan oleh stres oksidatif. Parameter ini merupakan indikator yang baik untuk memantau perkembangan stres oksidatif dalam organisme, karena protein—mengingat kandungan gugus pereduksinya yang melimpah—bukanlah biomolekul pertama yang menjadi sasaran stres oksidatif. Terjadinya kerusakan yang lebih signifikan pada molekul protein menandakan bahwa proses stres oksidatif telah berkembang lebih jauh dan penyakit dasarnya telah diperparah oleh pembentukan radikal bebas dalam jumlah besar serta terkurasnya mekanisme perlindungan antioksidan secara bersamaan. Kondisi ini khususnya umum ditemukan pada pasien penderita diabetes dan penyakit ginjal. Metode yang digunakan untuk menentukan kadar AOPP sebagai penanda stres oksidatif adalah metode yang ditetapkan oleh Witko-Sarsat dkk. Produk oksidasi protein bereaksi dengan asam asetat glasial dan kalium iodida, membentuk produk berwarna oranye dengan absorbansi maksimum pada panjang gelombang 340 nm. Konsentrasi AOPP dinyatakan dalam satuan ekuivalen kloramin-T yang digunakan untuk membuat kurva standar (pada rentang konsentrasi 10–100 µmol/L), di mana nilai absorbansi meningkat secara linear seiring dengan peningkatan konsentrasi. [44] Analisis terhadap hidrolisat yang terkandung dalam sediaan tersebut dilakukan menggunakan sistem gabungan kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS) dengan kolom kapiler HP-5MS. (Fakultas Kimia dan Teknologi, Universitas Split, Departemen Kimia Organik, Split, Kroasia)

3.3. Hasil

Tabel 2 menyajikan beberapa komponen terpenting dari keempat hidrolat yang menjadi bagian dari komposisi sediaan Med(i)ra yang diuji, beserta nilainya. Laporan lengkap mengenai pengujian komposisi masing-masing hidrolat secara terpisah disertakan dalam lampiran (Lampiran 1–4).

Bahasa Indonesia Part 2

Brand